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分析原理及流程之液相色譜
2013-06-14 [3331]

  液相色譜以經(jīng)典的液相色譜為基礎(chǔ),是以高壓下的液體為流動(dòng)相的色譜過程。通常所說的柱層析、薄層層析或紙層析就是經(jīng)典的液相色譜。所用的固定相為大于100um的吸附劑(硅膠、氧化鋁等)。這種傳統(tǒng)的液相色譜所用的固定相粒度大,傳質(zhì)擴(kuò)散慢,因而柱效低,分離能力差,只能進(jìn)行簡單混合物的分離。而液相所用的固定相粒度?。?um-10um)、傳質(zhì)快、柱效高。液相色譜法(HPLC)是20世紀(jì)60年代后期發(fā)展起來的一種分析方法。近年來,在保健食品功效成分、營養(yǎng)強(qiáng)化劑、維生素類、蛋白質(zhì)的分離測定等應(yīng)用廣泛。世界上約有80%的有機(jī)化合物可以用HPLC來分析測定。

  液相色譜分析原理(一)液相色譜分析的流程由泵將儲(chǔ)液瓶中的溶劑吸入色譜系統(tǒng),然后輸出,經(jīng)流量與壓力測量之后,導(dǎo)入進(jìn)樣器。被測物由進(jìn)樣器注入,并隨流動(dòng)相通過色譜柱,在柱上進(jìn)行分離后進(jìn)入檢測器,檢測信號(hào)由數(shù)據(jù)處理設(shè)備采集與處理,并記錄色譜圖。廢液流入廢液瓶。遇到復(fù)雜的混合物分離(極性范圍比較寬)還可用梯度控制器作梯度洗脫。這和氣相色譜的程序升溫類似,不同的是氣相色譜改變溫度,而HPLC改變的是流動(dòng)相極性,使樣品各組分在*條件下得以分離。

 ?。ǘ┮合嗌V的分離過程同其他色譜過程一樣,HPLC也是溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行的一種連續(xù)多次交換過程。它借溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離。開始樣品加在柱頭上,假設(shè)樣品中含有3個(gè)組分,A、B和C,隨流動(dòng)相一起進(jìn)入色譜柱,開始在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行分配。分配系數(shù)小的組分A不易被固定相阻留,較早地流出色譜柱。分配系數(shù)大的組分C在固定相上滯留時(shí)間長,較晚流出色譜柱。組分B的分配系數(shù)介于A,C之間,第二個(gè)流出色譜柱。若一個(gè)含有多個(gè)組分的混合物進(jìn)入系統(tǒng),則混合物中各組分按其在兩相間分配系數(shù)的不同先后流出色譜柱,達(dá)到分離之目的。

  不同組分在色譜過程中的分離情況,首先取決于各組分在兩相間的分配系數(shù)、吸附能力、親和力等是否有差異,這是熱力學(xué)平衡問題,也是分離的首要條件。其次,當(dāng)不同組分在色譜柱中運(yùn)動(dòng)時(shí),譜帶隨柱長展寬,分離情況與兩相之間的擴(kuò)散系數(shù)、固定相粒度的大小、柱的填充情況以及流動(dòng)相的流速等有關(guān)。所以分離zui終效果則是熱力學(xué)與動(dòng)力學(xué)兩方面的綜合效益。

  液相色譜的類型(一)吸附色譜在吸附色譜中,樣品的極性官能團(tuán)牢固地保留在填料的吸附活性中心上,非極性烴基幾乎不予保留。所以,要清楚地辨別極性功能團(tuán)的種類、數(shù)量和位置。通常,樣品能用吸附色譜分離的應(yīng)是能溶解于有機(jī)溶劑并是非離子型的,強(qiáng)離子樣品是不適宜的。

  吸附色譜所使用的流動(dòng)相以正己烷、三氯甲烷、二氯甲烷作為基礎(chǔ),按照樣品的極性加上乙醇,然而,是使所加入醇的濃度為10%或更少一些。如有可能,可進(jìn)一步減小百分?jǐn)?shù)。因?yàn)楦邼舛鹊拇紩?huì)減少填料的吸附活性,減弱吸附能力,并使重現(xiàn)困難。

  (二)分配色譜1.正相分配色譜正相分配色譜適用于不溶于水而溶于有機(jī)溶劑且?guī)в袠O性基團(tuán)的樣品,但正相分配色譜不適合于離子型物質(zhì)。

  2.反相分配色譜這種方法目前應(yīng)用非常廣泛,應(yīng)用的范圍也很廣,在反相分配色譜中,樣品的非極性部分起保留作用。

  通過使用的流動(dòng)相是水—甲醇和水—乙腈,通過加入甲醇或乙腈的量的不同來調(diào)節(jié)分離,但如果樣品帶有離子型基團(tuán),需要在流動(dòng)相中加入鹽或調(diào)節(jié)流動(dòng)相的PH值,例如,如果樣品有一個(gè)—COOH基團(tuán),使流動(dòng)相的PH值是偏向酸性的,由于抑制了—COOH基團(tuán)的電離而加強(qiáng)了保留。這個(gè)方法叫離子抑止法,如果樣品有強(qiáng)離子基,有時(shí)候采用在流動(dòng)相中加入適當(dāng)抗衡離子以形成離子對(duì)的離子對(duì)法。

  在調(diào)節(jié)PH值中,保持PH值在填料說明書手冊中所規(guī)定的范圍內(nèi),大多數(shù)化學(xué)鍵式的二氧化硅使用在PH=2-9,然而,當(dāng)加入鹽以后,使其PH=7.5-8或更小的,多孔聚合物填料能應(yīng)用非常廣泛的PH值。

 ?。ㄈ╇x子交換色譜這個(gè)方法是用填料的固定相的離子交換基團(tuán)和樣品的離子基團(tuán)之間的離子交換來分離樣品組分的,按照所交換的離子分成陽離子交換和陰離子交換。

  離子交換色譜使用于能溶于水的離子型物質(zhì)。在離子交換色譜中,流動(dòng)相的鹽的濃度、PH及鹽的種類等都對(duì)保留值有很大的影響。在液相色譜的離子交換中所用的鹽有磷酸鹽、醋酸鹽和硼酸鹽。因?yàn)槁然飼?huì)腐蝕不銹鋼儀器,在液相色譜中不能使用NaCI或其他的氯化物鹽類。根據(jù)測量波長有些鹽也不能使用,例如,醋酸吸收大約在210nm,當(dāng)檢測處在短波端的時(shí)候,用醋酸作流動(dòng)相是不合適的。

 ?。ㄋ模┠z色譜凝膠色譜不同于以上三種分離方法。凝膠色譜是根據(jù)分子大小用分子篩效應(yīng)來分離樣品組分的。這個(gè)方法也叫排阻色譜或粒度排阻色譜。具有一定孔徑的多孔性合成聚合物經(jīng)常用作填料。

  因?yàn)樵跇悠分?,小尺寸的分子深深地滲透到微孔中,所以遲流出,而大尺寸的分子沒有滲透到微孔中,就很快流出。通常合成樹脂的分離使用有機(jī)溶劑作流動(dòng)相,叫做凝膠滲透色譜。

  凝膠色譜依樣品的性質(zhì)又可分為凝膠滲透和凝膠過濾。

  1.凝膠滲透色譜凝膠滲透色譜(GelPermeationChromatography),簡稱GPC。此一類的色譜,使用于有機(jī)性溶媒的樣品中,如PVC,PS,ABS等等,而所用的洗脫液有THF,Chloroform等等。

  2.凝膠過濾色譜凝膠過濾色譜(GelFiltrarionChromatography),簡稱GFC。此一種類的層析法,使用于水溶媒的試劑中,如蛋白質(zhì)、淀粉及水性合成高分子等等,而所用的溶液有水、緩沖液等等。

  凝膠的種類很多,按其原料來源可分為有機(jī)膠和無機(jī)膠。按其制備的方法又可分為均勻、半均勻和非均勻三種凝膠。而根據(jù)凝膠的強(qiáng)度又可分為軟膠、半硬膠和硬膠三大類。根據(jù)它對(duì)溶劑的適用范圍又可分為親水性、親油性和兩性凝膠等等。

 附:液相色譜是目前應(yīng)用zui多的色譜分析方法,液相色譜系統(tǒng)由流動(dòng)相儲(chǔ)液體瓶、輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器和記錄器組成,其整體組成類似于氣相色譜,但是針對(duì)其流動(dòng)相為液體的特點(diǎn)作出很多調(diào)整。

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