反相液相色譜法分離和測(cè)定富馬酸
2011-11-03
[6208]
摘 要 采用反相液相色譜法測(cè)定富馬酸。在μ-Bondapark C18色譜柱上以含0.5%乙酸的水溶液作為流動(dòng)相能較好地分離富馬酸和馬來(lái)酸試樣，當(dāng)其流速為1.0 mL/min時(shí)，富馬酸與馬來(lái)酸的分離因子的分離度達(dá)1.52。該方法操作簡(jiǎn)便、快速、定量準(zhǔn)確、可靠。
1 引 言
富馬酸是一種重要的精細(xì)化工產(chǎn)品的原料。它可用于合成不飽和聚酯樹(shù)脂，它與醋酸乙烯的共聚物是良好的粘合劑，與苯乙烯的共聚物是制造玻璃鋼的材料；它也是一種食品添加劑（酸味劑），并可用于合成新型防霉劑——霉克星。此外，它也是重要的醫(yī)藥原料，如反丁烯二酸鐵用于冶療小紅血球型貧血的富血鐵〔1〕。有關(guān)其殘留的分析測(cè)定國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道〔2～5〕，但有關(guān)其工業(yè)生產(chǎn)的控制分析國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。我們采用反相液相色譜法分離和測(cè)定工業(yè)產(chǎn)品中富馬酸含量以及馬來(lái)酸樣品中富馬酸雜質(zhì)含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法*適合于工業(yè)產(chǎn)品中富馬酸的含量的測(cè)定和馬來(lái)酸試樣中富馬酸雜質(zhì)的測(cè)定。
2 實(shí)驗(yàn)部分
2.1 試劑和儀器
Shimadzau LC-4A液相色譜儀；Waters 4801 液相色譜光譜檢測(cè)儀；Waters 991二極管陣列檢測(cè)儀；Shimadzu C-R2A色譜數(shù)據(jù)處理儀；
富馬酸標(biāo)準(zhǔn)品：99%（浙江工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院精細(xì)化工研究室）；馬來(lái)酸標(biāo)準(zhǔn)品：98%（浙江工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院精細(xì)化工研究室）；其它所用試劑均為分析純?cè)噭?。富馬酸及馬來(lái)酸樣品是由浙江工業(yè)大學(xué)精細(xì)化工研究室提供的小試合成樣品。
2.2 液相色譜條件
色譜柱： C18色譜柱（30 cm×3.9 mm I.D）；流動(dòng)相：含0.5%乙酸的水溶液；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm（靈敏度為0.01 AU）。進(jìn)樣量：20μL。
富馬酸是一種重要的精細(xì)化工產(chǎn)品的原料。它可用于合成不飽和聚酯樹(shù)脂，它與醋酸乙烯的共聚物是良好的粘合劑，與苯乙烯的共聚物是制造玻璃鋼的材料；它也是一種食品添加劑（酸味劑），并可用于合成新型防霉劑——霉克星。此外，它也是重要的醫(yī)藥原料，如反丁烯二酸鐵用于冶療小紅血球型貧血的富血鐵〔1〕。有關(guān)其殘留的分析測(cè)定國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道〔2～5〕，但有關(guān)其工業(yè)生產(chǎn)的控制分析國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。我們采用反相液相色譜法分離和測(cè)定工業(yè)產(chǎn)品中富馬酸含量以及馬來(lái)酸樣品中富馬酸雜質(zhì)含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法*適合于工業(yè)產(chǎn)品中富馬酸的含量的測(cè)定和馬來(lái)酸試樣中富馬酸雜質(zhì)的測(cè)定。
2 實(shí)驗(yàn)部分
2.1 試劑和儀器
Shimadzau LC-4A液相色譜儀；Waters 4801 液相色譜光譜檢測(cè)儀；Waters 991二極管陣列檢測(cè)儀；Shimadzu C-R2A色譜數(shù)據(jù)處理儀；
富馬酸標(biāo)準(zhǔn)品：99%（浙江工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院精細(xì)化工研究室）；馬來(lái)酸標(biāo)準(zhǔn)品：98%（浙江工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院精細(xì)化工研究室）；其它所用試劑均為分析純?cè)噭?。富馬酸及馬來(lái)酸樣品是由浙江工業(yè)大學(xué)精細(xì)化工研究室提供的小試合成樣品。
2.2 液相色譜條件
色譜柱： C18色譜柱（30 cm×3.9 mm I.D）；流動(dòng)相：含0.5%乙酸的水溶液；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm（靈敏度為0.01 AU）。進(jìn)樣量：20μL。
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在此操作條件下，富馬酸和馬來(lái)酸樣品及其標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖1所示。
圖1 富馬酸試樣的色譜圖
Fig.1 Chromatogram of fumaric acid samples
a.富馬酸和馬來(lái)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（standard solution of fumaric acid and malic acid mixture）；b.富馬酸樣品（fumaric acid sample）；c.馬來(lái)酸樣品（malic acid sample）。1.馬來(lái)酸（malic acid）；2.富馬酸（fumaric acid）。
μ-Bondapark C18色譜柱（30 cm×3.9 mm I.D）。
2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
準(zhǔn)確稱取富馬酸標(biāo)準(zhǔn)品約0.015 g（至±0.01 mg）置于10 mL容量瓶中，用5 mL甲醇溶解并用流動(dòng)相稀釋至刻度。然后逐步稀釋得不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，其濃度分別為1.5×10-3，3.0×10-3，4.5×10-3，6.0×10-3，7.5×10-3，10.5×10-3，15.0×10-3 g/L。
2.4 樣品溶液的配制
準(zhǔn)確稱取一定量試樣（至±0.01 mg）置于10 mL容量瓶中，用5 mL甲醇溶解并用流動(dòng)相稀釋至刻度。然后逐步稀釋至一定濃度，待測(cè)定。
3 結(jié)果與討論
3.1 流動(dòng)相選擇
作者首先考察了不同流動(dòng)相對(duì)試樣中富馬酸與其雜質(zhì)的分離效果，發(fā)現(xiàn)試樣在100%甲醇為流動(dòng)相和以純水為流動(dòng)相時(shí)試樣中的富馬酸及雜質(zhì)馬來(lái)酸等出峰較快，基本上與溶劑一起流出，而當(dāng)流動(dòng)相為含乙酸水溶液時(shí)富馬酸與馬來(lái)酸等之間具有較好的分離效果，而且流動(dòng)相中乙酸含量不同對(duì)其分離效果產(chǎn)生明顯影響。
隨著乙酸濃度的增加，馬來(lái)酸的容量因子（k′1）隨之減少，而富馬酸的容量因子（k′2）先隨乙酸濃度的增加而增加，當(dāng)乙酸濃度＞1.0%時(shí)，其容量因子顯著減少。從而使馬來(lái)酸與富馬酸之間的分離因子（α）和分離度（R）在流動(dòng)相中乙酸濃度為1.0%時(shí)，兩者均達(dá)到zui大值，即α=2.02，R=2.32。同時(shí)考慮到色譜柱的使用壽命，我們認(rèn)為采用含0.5%乙酸水溶液為流動(dòng)相較為合適，因?yàn)楫?dāng)采用0.5%乙酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)，馬來(lái)酸與富馬酸之間的分離因子和分離度分別達(dá)1.62和1.52，已滿足定量測(cè)定要求。
3.2 流速的影響
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)以含0.5%乙酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)，在室溫下改變其流速時(shí)，其保留時(shí)間、柱效均發(fā)生變化，即隨著流速的降低，保留時(shí)間和柱效隨之增加，而容量因子（k′）基本不變。這是由于流速降低時(shí)，流動(dòng)相中傳質(zhì)阻力Hm、停滯流動(dòng)相中傳質(zhì)阻力Hsm和固定相內(nèi)傳質(zhì)阻力Hs都降低，縱向分子擴(kuò)散雖有所增加，但在此濃度范圍內(nèi)，前三項(xiàng)的影響是主要的，后一項(xiàng)可忽略。因此，流速降低，柱效增大。而容量因子（k′）是熱力學(xué)參數(shù)，它與流動(dòng)相的流速無(wú)關(guān)，因此流動(dòng)相的流速的變化基本不影響馬來(lái)酸與富馬酸之間的分離因子，其α=1.57，流速選為1.0 mL/min。
3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇
富馬酸是一個(gè)不飽和有機(jī)酸，它受紫外光的激發(fā)后可以發(fā)生σ→π*，π→π*，n→π*躍遷，因此它在紫外的短波區(qū)有強(qiáng)烈的吸收，λmax,CH3OH=207 nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在乙酸/水體系中富馬酸在λ=240 nm附近有強(qiáng)吸收。
乙酸濃度對(duì)富馬酸和馬來(lái)酸的紫外吸收帶有著明顯的影響，當(dāng)乙酸濃度增加時(shí)，富馬酸的zui大吸收波長(zhǎng)顯著向長(zhǎng)波方向位移，即產(chǎn)生紅移。當(dāng)乙酸濃度從0.5%增加到2.0%時(shí)，富馬酸的zui大吸收波長(zhǎng)從236 nm位移至248 nm。并且，隨著乙酸濃度的增加，兩者的紫外吸收譜帶變狹。為此，選用0.5%乙酸溶液為流動(dòng)相時(shí)，測(cè)定波長(zhǎng)選擇為λ=240 nm。
3.4 溶劑的選擇
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，試樣經(jīng)甲醇溶解后采用不同溶劑稀釋，其色譜圖明顯不同，如用水稀釋時(shí)色譜圖中產(chǎn)生一個(gè)較大的體系峰（負(fù)峰），而且該體系峰與馬來(lái)酸的色譜峰非常接近；而采用流動(dòng)相稀釋時(shí)，體系峰較小，使體系峰與馬來(lái)酸的峰*分離。因此，選擇流動(dòng)相作為稀釋溶劑。
3.5 方法的線性范圍和檢測(cè)限
將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液在上述選定的色譜測(cè)定條件下分別進(jìn)行分析測(cè)定,進(jìn)樣體積為20 μL。以濃度（C）為橫坐標(biāo),峰面積（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,富馬酸的濃度在2.4×10-3～12.2×10-3 g/L內(nèi)，富馬酸的濃度與其峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為A=0.1933C+0.0452（r=0.9979）。方法的檢測(cè)限為7.7×10-2 mg/L（按信噪比2∶1）。
3.6 精密度和準(zhǔn)確度
為了考察該方法的重現(xiàn)性,對(duì)同一試樣進(jìn)行了5次重復(fù)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.81,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.91%。
在已知含量的樣品中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品后進(jìn)行多次測(cè)定。測(cè)得富馬酸的回收率為 98.86%～103.9%,平均回收率為101.0%。
表1 樣品中富馬酸含量測(cè)定結(jié)果
Table 1 Determination results of concentration of fumaric acid in sample
樣 品
Sample 測(cè)定結(jié)果 Determination results （%） 平均值
Mean value （%）
1 2 3
馬來(lái)酸樣品 Malic acid sample 8.80 9.06 8.84 8.90
富馬酸樣品 Fumaric acid sample 88.74 87.50 87.96 88.07
3.7 實(shí)際樣品的測(cè)定
該方法用于測(cè)定富馬酸和馬來(lái)酸樣品中富馬酸含量，結(jié)果見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法*適合于富馬酸產(chǎn)品和馬來(lái)酸產(chǎn)品中富馬酸含量測(cè)定。
作者單位：施介華（浙江工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，杭州 310032）
徐秀珠（浙江大學(xué)分析測(cè)試中心，杭州 310027）
References
［1］ Zhang Sigui（章思規(guī)），Xin Zhong（辛 忠）. Handbook of Preparation of Fine Organic Chemical Engineering（精細(xì)有機(jī)化工制備手冊(cè)）. Beijing（北京）：Science and Technology Literature Press （科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社），1994:386～387
［2］ Chen Dayi（陳大義）. Chinese J. Preventive Medicine（中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志），1996，30（1）：52
［3］ Yu Zhaolou（余兆樓），Chang Liwen（常理文）. Chinese J. Chromatogr.（色譜），1992，10（6）：336～338
［4］ Dietz E A, Singley K F. J. Liq. Chromatogr., 1994, 17（7）:1637～1651
［5］ Llorente M, Villaroya B, Gomez-Cordoves C. Chromatographia, 1991, 32（11／12）:555～558
在此操作條件下，富馬酸和馬來(lái)酸樣品及其標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖1所示。
圖1 富馬酸試樣的色譜圖
Fig.1 Chromatogram of fumaric acid samples
a.富馬酸和馬來(lái)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（standard solution of fumaric acid and malic acid mixture）；b.富馬酸樣品（fumaric acid sample）；c.馬來(lái)酸樣品（malic acid sample）。1.馬來(lái)酸（malic acid）；2.富馬酸（fumaric acid）。
μ-Bondapark C18色譜柱（30 cm×3.9 mm I.D）。
2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
準(zhǔn)確稱取富馬酸標(biāo)準(zhǔn)品約0.015 g（至±0.01 mg）置于10 mL容量瓶中，用5 mL甲醇溶解并用流動(dòng)相稀釋至刻度。然后逐步稀釋得不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，其濃度分別為1.5×10-3，3.0×10-3，4.5×10-3，6.0×10-3，7.5×10-3，10.5×10-3，15.0×10-3 g/L。
2.4 樣品溶液的配制
準(zhǔn)確稱取一定量試樣（至±0.01 mg）置于10 mL容量瓶中，用5 mL甲醇溶解并用流動(dòng)相稀釋至刻度。然后逐步稀釋至一定濃度，待測(cè)定。
3 結(jié)果與討論
3.1 流動(dòng)相選擇
作者首先考察了不同流動(dòng)相對(duì)試樣中富馬酸與其雜質(zhì)的分離效果，發(fā)現(xiàn)試樣在100%甲醇為流動(dòng)相和以純水為流動(dòng)相時(shí)試樣中的富馬酸及雜質(zhì)馬來(lái)酸等出峰較快，基本上與溶劑一起流出，而當(dāng)流動(dòng)相為含乙酸水溶液時(shí)富馬酸與馬來(lái)酸等之間具有較好的分離效果，而且流動(dòng)相中乙酸含量不同對(duì)其分離效果產(chǎn)生明顯影響。
隨著乙酸濃度的增加，馬來(lái)酸的容量因子（k′1）隨之減少，而富馬酸的容量因子（k′2）先隨乙酸濃度的增加而增加，當(dāng)乙酸濃度＞1.0%時(shí)，其容量因子顯著減少。從而使馬來(lái)酸與富馬酸之間的分離因子（α）和分離度（R）在流動(dòng)相中乙酸濃度為1.0%時(shí)，兩者均達(dá)到zui大值，即α=2.02，R=2.32。同時(shí)考慮到色譜柱的使用壽命，我們認(rèn)為采用含0.5%乙酸水溶液為流動(dòng)相較為合適，因?yàn)楫?dāng)采用0.5%乙酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)，馬來(lái)酸與富馬酸之間的分離因子和分離度分別達(dá)1.62和1.52，已滿足定量測(cè)定要求。
3.2 流速的影響
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)以含0.5%乙酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)，在室溫下改變其流速時(shí)，其保留時(shí)間、柱效均發(fā)生變化，即隨著流速的降低，保留時(shí)間和柱效隨之增加，而容量因子（k′）基本不變。這是由于流速降低時(shí)，流動(dòng)相中傳質(zhì)阻力Hm、停滯流動(dòng)相中傳質(zhì)阻力Hsm和固定相內(nèi)傳質(zhì)阻力Hs都降低，縱向分子擴(kuò)散雖有所增加，但在此濃度范圍內(nèi)，前三項(xiàng)的影響是主要的，后一項(xiàng)可忽略。因此，流速降低，柱效增大。而容量因子（k′）是熱力學(xué)參數(shù)，它與流動(dòng)相的流速無(wú)關(guān)，因此流動(dòng)相的流速的變化基本不影響馬來(lái)酸與富馬酸之間的分離因子，其α=1.57，流速選為1.0 mL/min。
3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇
富馬酸是一個(gè)不飽和有機(jī)酸，它受紫外光的激發(fā)后可以發(fā)生σ→π*，π→π*，n→π*躍遷，因此它在紫外的短波區(qū)有強(qiáng)烈的吸收，λmax,CH3OH=207 nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在乙酸/水體系中富馬酸在λ=240 nm附近有強(qiáng)吸收。
乙酸濃度對(duì)富馬酸和馬來(lái)酸的紫外吸收帶有著明顯的影響，當(dāng)乙酸濃度增加時(shí)，富馬酸的zui大吸收波長(zhǎng)顯著向長(zhǎng)波方向位移，即產(chǎn)生紅移。當(dāng)乙酸濃度從0.5%增加到2.0%時(shí)，富馬酸的zui大吸收波長(zhǎng)從236 nm位移至248 nm。并且，隨著乙酸濃度的增加，兩者的紫外吸收譜帶變狹。為此，選用0.5%乙酸溶液為流動(dòng)相時(shí)，測(cè)定波長(zhǎng)選擇為λ=240 nm。
3.4 溶劑的選擇
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，試樣經(jīng)甲醇溶解后采用不同溶劑稀釋，其色譜圖明顯不同，如用水稀釋時(shí)色譜圖中產(chǎn)生一個(gè)較大的體系峰（負(fù)峰），而且該體系峰與馬來(lái)酸的色譜峰非常接近；而采用流動(dòng)相稀釋時(shí)，體系峰較小，使體系峰與馬來(lái)酸的峰*分離。因此，選擇流動(dòng)相作為稀釋溶劑。
3.5 方法的線性范圍和檢測(cè)限
將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液在上述選定的色譜測(cè)定條件下分別進(jìn)行分析測(cè)定,進(jìn)樣體積為20 μL。以濃度（C）為橫坐標(biāo),峰面積（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,富馬酸的濃度在2.4×10-3～12.2×10-3 g/L內(nèi)，富馬酸的濃度與其峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為A=0.1933C+0.0452（r=0.9979）。方法的檢測(cè)限為7.7×10-2 mg/L（按信噪比2∶1）。
3.6 精密度和準(zhǔn)確度
為了考察該方法的重現(xiàn)性,對(duì)同一試樣進(jìn)行了5次重復(fù)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.81,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.91%。
在已知含量的樣品中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品后進(jìn)行多次測(cè)定。測(cè)得富馬酸的回收率為 98.86%～103.9%,平均回收率為101.0%。
表1 樣品中富馬酸含量測(cè)定結(jié)果
Table 1 Determination results of concentration of fumaric acid in sample
樣 品
Sample 測(cè)定結(jié)果 Determination results （%） 平均值
Mean value （%）
1 2 3
馬來(lái)酸樣品 Malic acid sample 8.80 9.06 8.84 8.90
富馬酸樣品 Fumaric acid sample 88.74 87.50 87.96 88.07
3.7 實(shí)際樣品的測(cè)定
該方法用于測(cè)定富馬酸和馬來(lái)酸樣品中富馬酸含量，結(jié)果見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法*適合于富馬酸產(chǎn)品和馬來(lái)酸產(chǎn)品中富馬酸含量測(cè)定。
作者單位：施介華（浙江工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，杭州 310032）
徐秀珠（浙江大學(xué)分析測(cè)試中心，杭州 310027）
References
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［5］ Llorente M, Villaroya B, Gomez-Cordoves C. Chromatographia, 1991, 32（11／12）:555～558
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